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El diseño, construcción y caracterización de nuevos biorreactores nanovibracionales para osteogénesis - Phys.org

Diseño de la herramienta de moldeo por inyección y análisis de llenado de molde utilizando simulaciones antes de la fabricación (A) Se muestra una vista despiezada de la herramienta de molde con placa de cultivo para ilustrar los componentes principales de la interfaz del molde y el sistema de expulsión. (B) muestra el análisis de llenado del molde que estima que la cavidad de la pieza en la herramienta debería tardar 3,65 segundos en llenarse por completo, dando una pieza libre de defectos. Crédito: Informes científicos, doi: 10.1038 / s41598-019-49422-4              En medicina regenerativa, los científicos apuntan a avanzar significativamente las técnicas que pueden controlar el compromiso del linaje de células madre. Por ejemplo, la estimulación mecánica de las células madre mesenquimales (MSC) a escala nanométrica puede activar las vías de mecanotransducción para estimular la osteogénesis (desarrollo óseo) en cultivos 2-D y 3-D. Tal trabajo puede revolucionar los procedimientos de injerto óseo al crear material de injerto a partir de fuentes autólogas o alogénicas de MSC sin inducir químicamente el fenómeno. Debido al creciente interés biomédico en dicha estimulación mecánica de las células para uso clínico, tanto los investigadores como los médicos requieren un sistema de biorreactor escalable para proporcionar resultados reproducibles de manera consistente. En un nuevo estudio publicado ahora en Scientific Reports, Paul Campsie y un equipo de investigadores multidisciplinarios en los departamentos de ingeniería biomédica, informática, física y biología molecular, celular y de sistemas diseñaron un nuevo sistema de biorreactor para cumplir con los requisitos existentes.                                                       El nuevo instrumento contenía una placa de vibración para biorreacciones, calibrada y optimizada para vibraciones nanométricas a 1 kHz, una unidad de fuente de alimentación para generar una amplitud de vibración de 30 nm y material de cultivo personalizado de seis pocillos para el crecimiento celular. El material de cultivo contenía inserciones magnéticas para unirse a la placa de vibración magnética del biorreactor. Evaluaron la expresión de proteínas osteogénicas para confirmar la diferenciación de las MSC después de los experimentos biológicos iniciales dentro del sistema. Campsie y col. realizó microscopía de fuerza atómica (AFM) de las construcciones de gel en 3-D para verificar que el endurecimiento por deformación del gel no se produjo durante la estimulación vibratoria. Los resultados confirmaron que la diferenciación celular es el resultado de las estimulaciones nano-vibracionales proporcionadas por el biorreactor solo. La creciente incidencia de lesiones esqueléticas debido a afecciones relacionadas con la edad, como la osteoporosis y la osteoartritis, es una medida de la calidad agotadora de la vida humana. El desarrollo de tratamientos para el aumento de la densidad ósea o la curación de fracturas son objetivos principales para el potencial regenerativo de las células madre mesenquimales (MSC). Los investigadores han demostrado osteogénesis controlada (desarrollo de huesos) de MSC mediante estimulación mecánica utilizando varios métodos, incluidas estrategias pasivas y activas. Los métodos pasivos suelen alterar la topografía del sustrato para influir en el perfil de adhesión celular, mientras que los métodos activos incluyen la exposición a fuerzas variadas de fuentes externas.                               El análisis FEA se realizó en el banco de trabajo ANSYS 17.1 para determinar la respuesta armónica a 1 kHz en la disposición de la placa superior de trece y quince conjuntos de piezo. (A) Diagrama de trece conjuntos piezoeléctricos. (B) Diagrama de quince conjuntos piezoeléctricos. (C) Desplazamiento previsto a nanoescala de trece conjuntos piezoeléctricos a 1 kHz. (D) Desplazamiento previsto a nanoescala de quince conjuntos piezoeléctricos a 1 kHz. Crédito: Informes científicos, doi: 10.1038 / s41598-019-49422-4.              El presente trabajo de Campsie et al. pretenden progresar en diseños preexistentes para la osteogénesis controlada de MSC para construir un sistema compatible con Good Manufacturing Practice (GMP) aplicable para ensayos clínicos a pequeña escala. Durante la construcción, el equipo utilizó interferometría láser para medir con precisión el desplazamiento de la vibración desde la placa superior del biorreactor y dentro de los pozos utilizados para el material de cultivo para validar el equipo que desarrollaron en base a modelos de análisis elemental finito (FEA). El equipo usó un generador de forma de onda de síntesis digital directa (DDS) y un filtro de reconstrucción para eliminar componentes de alta frecuencia de la salida DDS para generar una salida de onda sinusoidal pura de 1 kHZ para nanovibraciones precisas.                                                                                      El equipo de investigación validó la operación del sistema de biorreactor mediante la realización de experimentos biológicos para cuantificar la expresión de proteínas osteogénicas de las MSC expuestas a la estimulación nano-vibracional. Realizaron mediciones de AFM en el gel de colágeno utilizado en los experimentos para determinar las vibraciones transmitidas desde el material de cultivo al gel. Luego demostraron que la rigidez del gel no aumentó significativamente en respuesta a las nanovibraciones que ocurrieron.                               Mediciones del ángulo de contacto con el agua del material de cultivo de PP después de diferentes dosis de tratamiento con plasma e imágenes de microscopía de células MG63 (células osteogénicas) en placas de PP y poliestireno (PS) de 6 pocillos. Un gráfico de mediciones de WCA después del tratamiento con plasma (A) muestra que se requieren al menos 30 segundos para alterar significativamente el WCA a un nivel que permita que las células se adhieran y proliferen. Imágenes de (B) no adherencia de las células MG63 en la placa PP de 6 pocillos antes del tratamiento con plasma, (C) adhesión y proliferación de células MG63 en la placa PP 6 de plasma tratada con plasma, y ​​(D) células MG63 cultivadas en un estándar Placa Corning PS de 6 pocillos. Crédito: Informes científicos, doi: 10.1038 / s41598-019-49422-4.              Campsie y col. construyó el biorreactor con opciones de materiales específicos y accesorios de cultivo para ofrecer vibraciones óptimas a nanoescala entre las frecuencias de 1 Hz y 5 kHz. Aseguraron que la frecuencia de resonancia del aparato esté muy por encima de la frecuencia de operación para evitar la amplificación o amortiguación de resonancia. Para determinar las dimensiones apropiadas del dispositivo, el equipo de investigación realizó FEA utilizando el software ANSYS Workbench. Los científicos crearon los biorreactores de forma económica mediante el uso de 13 a 15 matrices piezoeléctricas para su construcción. El diseño del producto permitió distintas bandas alternas de desplazamiento mínimo y máximo para que las células reciban niveles inconsistentes de vibraciones a través del material de cultivo. El equipo estimó la frecuencia de resonancia intrínseca de los piezoaccionadores y otros componentes del dispositivo para comprender su impacto en la configuración experimental. Luego, el equipo de investigación modificó la química de la superficie del material de cultivo de plástico para ayudar a la adhesión y proliferación celular utilizando la activación de la superficie del plasma para aumentar la energía superficial del polímero. Después de cinco minutos de tratamiento con plasma basado en aire, cultivaron células similares a osteoblastos humanos para observar un aumento de la unión celular al material de cultivo. Midieron el ángulo de contacto con el agua del polímero para determinar la energía superficial de la modificación y la humectabilidad de la superficie. Los científicos demostraron una prueba de principio sobre la activación por plasma de material de cultivo polimérico y su impacto en la humectabilidad de la superficie para una unión celular favorable. Su objetivo era desarrollar aún más las superficies de los utensilios de cultivo de manera similar para garantizar su estabilidad y vida útil.                               ARRIBA: placa de vibración de biorreactor con material de cultivo de 6 pocillos PP moldeado por inyección. (A) La versión mejorada del biorreactor tiene una base más liviana, asas de transporte y una placa superior empotrada, junto con una fuente de alimentación diseñada para emitir una onda sinusoidal de 1? KHz y una amplitud de desplazamiento de 30? Nm. (B) Material de cultivo de PP moldeado por inyección con imanes de anillo de ferrita halbach incorporados en la base de cada pocillo. El grosor del marco y las paredes de los pozos es de 1.5 mm. ABAJO: Configuración de medición de interferómetro y señal de salida. (A) Para medir los desplazamientos a nanoescala, el interferómetro emite un rayo láser desde la cabeza del láser que se refleja en el fotodetector (también dentro de la cabeza del láser) del objeto que se está midiendo. El análisis del patrón de interferencia óptica producido permite obtener el desplazamiento. (B) Ejemplo de datos de series de tiempo medidos por el interferómetro. (C) Ejemplo de un análisis FFT en los datos de series temporales. El pico de 1? KHz del biorreactor se ve claramente y también hay un pico grande a 750? Hz, sin embargo, esta señal es producida por el espejo de referencia del interferómetro que se excita constantemente a una frecuencia fija para obtener el control señales Crédito: Informes científicos, doi: 10.1038 / s41598-019-49422-4.              El equipo de investigación mejoró significativamente el diseño del biorreactor en el presente trabajo para formar una base más ligera en comparación con el prototipo que presentaron previamente. Utilizaron un generador de forma de onda de potencia AD9833 para la fuente de alimentación con una sintonización fácil y mantuvieron un filtrado apropiado para derivar una señal de impulsión de onda sinusoidal pura de 1 kHz. Los investigadores obtuvieron un espectro de potencia de la señal prefiltrada y posfiltrada para estimar la densidad espectral de potencia del generador. Verificaron el modelado y calibración FEA del biorreactor utilizando un interferómetro láser para determinar los cambios en el desplazamiento a nanoescala. Los científicos utilizaron cinta reflectante prismática unida a la superficie inferior de cada pozo para medir las dimensiones de los pozos de cultivo que se unieron magnéticamente al biorreactor. Esta tecnología tiene un gran alcance para generar una matriz mineralizada en 3-D a partir de MSC sembradas en un gel de colágeno para formar andamios óseos. Por ejemplo, las células cultivadas recibieron una fuerza de aceleración periódica durante la vibración, que actuó sobre la membrana celular y el citoesqueleto para inducir la osteogénesis. El efecto también podría estar relacionado con la rigidez ambiental dentro de los medios de cultivo celular, afectando la diferenciación de células madre e induciendo osteogénesis en MSC. Para diferenciar la causa, Campsie et al. usó AFM para detectar cualquier cambio en la rigidez mientras nanovibraban el gel de colágeno. No observaron efectos significativos del endurecimiento por deformación dentro del gel y el módulo de Young mantuvo valores de geles de colágeno blando; atribuyendo así la diferenciación celular a la nanovibración sola.



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